出現(xiàn)峰形異常原因及解決方案
實驗時遇到峰形異常的情況很多，造成峰形異常的因素很多，柱外死體積算是比較常見的原因之一，柱外死體積引起峰形異常有個特點，對先出的峰影響大，對后出峰影響小；柱頭塌陷、柱頭和篩板污染等都會引起所有的峰形都異常，硅醇基次級保留則引起部分峰發(fā)生拖尾現(xiàn)象。
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峰形異常常見形式
峰形異常常見形式包括峰后拖、峰前延等
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峰后拖
常見的3種拖尾情況
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引起峰后拖的原因
反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等極性基團的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，這些硅膠表面殘留硅羥基對極性和堿性樣品分子產(chǎn)生次級保留效應。
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反相填料表面有殘余的硅羥基，也會引起峰后拖
根據(jù)電離規(guī)律，流動相的pH-pKa>2即pH>6.7時，99%以上的硅羥基應該是呈離子狀態(tài)的，即Si-O- ，而pKa-pH>2即pH<2.5時，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99%以上的硅羥基應該是呈分子狀態(tài)的，即Si-OH，但其極性仍然存在，即Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-對于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強得多。
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硅膠表面由于鍵合了C18長鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機會不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強的靜電作用而被推遲洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。
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相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能降低峰拖尾的情形，獲得良好的峰形。恒譜生?C18系列液相色譜柱采取的就是高密鍵合和徹底的雙峰尾工藝。
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峰前延
三種峰前延的表現(xiàn)形式
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造成前延峰的原因有多種，大致可分為以下幾種
原因一，樣品過載
如果色譜柱中樣品含量過高，可能產(chǎn)生前延峰，一般認為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過載影響峰形。通過降低樣品濃度，其峰形會逐漸正常。
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原因二，檢查溶解樣品使用了流動相
溶解樣品的溶劑洗脫能力比流動相強，就會發(fā)生峰前延。這對這種情況，可以酌情替換流動相填料。
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正常來講，峰形應該是樣品在色譜柱上均勻的前移的情況下得到的，濃度分布在整個通過色譜柱柱床的過程中任何時候都呈正態(tài)分布。
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樣品溶液進樣后到達色譜柱時間很短，應還未被流動相充分稀釋，洗脫能力更強的樣品溶劑的局部存在，將使部分樣品被洗脫的速度加快，導致峰前延。
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原因三，流動相中緩沖鹽的濃度過低
緩沖鹽濃度過低可能導致色譜柱發(fā)生峰前延，因此很多人員在實驗時會增大流動相中的離子強度。
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原因四，柱溫過低
過低的柱溫會導致前延峰的產(chǎn)生，通過升溫，可以增加流動相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用引起的前拖，但溫度不宜太高，溫度太高容易損傷色譜柱，特別是含有離子對試劑的時候，最好不要超過40℃。
如何延長色譜柱使用壽命
色譜柱如果得到正確使用、維護和保養(yǎng)，壽命會很長。在使用保護柱的情況下，有壽命超過1萬針的實例。如果不用保護柱，即便得到很好保養(yǎng)維護，一般能用到2000針左右就不錯了。
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色譜柱是高檔儀器中的高檔部件，表面看，一支只有和筷子一樣大小的色譜柱，2000-5000元價格算比較昂貴了，但色譜柱的使用成本占整個分析成本的比例卻很低。因為色譜柱是耗材中可重復試用次數(shù)算多的，按平均用2000次計算，單次使用成本僅有1-2元人民幣，與制樣和試劑成本相比，幾乎可忽略不計。
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為了確保色譜柱的使用壽命，有條件的實驗室，建議每支色譜柱固定做一種分析方法。盡管這樣需要準備的色譜柱數(shù)量會多一些，但從長時間維度看。這種方法可以有效減少色譜柱來回切換產(chǎn)生的問題，降低損耗，總體成本也會更低。
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發(fā)布于: 2024-07-13